文献解读
破解大豆根腐病难题：核效应子PsAvh110干扰宿主转录复合物的机制研究
在农业生产中，由疫霉菌（Phytophthora）引起的病害一直是威胁作物产量的重大挑战，其中大豆疫霉（Phytophthora sojae）导致的大豆根腐病更是全球大豆产业的“心腹大患”，可造成严重的经济损失。这类病原微生物之所以难以防治，核心在于其能分泌大量“效应子”（effector）进入植物细胞，精准干扰宿主的免疫防御系统，从而实现侵染与定殖。
今天和大家分享一篇关于大豆疫霉核效应子PsAvh110对植物免疫的调控作用的文章，该文章于2022年10月发表在Plant Cell杂志上，标题为“The Phytophthora sojae nuclear effector PsAvh110 targets a host transcriptional complex to modulate plant immunity”。
01研究思路
该研究围绕大豆疫霉核效应子PsAvh110调控植物免疫的机制展开，通过系列技术层层解析：以荧光标记结合共定位实验证实其核定位及核定位信号（NLS）的必要性；用CRISPR/Cas9构建敲除突变体并结合回补实验，验证核定位与毒力的关联；通过转录组测序筛选受其抑制的免疫基因（如 GmBAK1-3、GmPR1），双荧光素酶报告实验证实对基因启动子的抑制；酵母双杂交筛选到互作蛋白 GmLHP1-2，经Co-IP、BiFC及体外pull-down实验明确互作依赖PsAvh110的W2基序与GmLHP1-2 的C端染色质阴影域；借助竞争结合实验、微量热泳动证实PsAvh110与GmPHD6竞争性结合 GmLHP1-2，破坏转录复合物；通过ChIP-qPCR、凝胶阻滞实验，明确复合物结合免疫基因启动子的 G-rich元件激活转录，而PsAvh110会抑制该过程；最终结合突变体实验及序列保守性分析，提出其作用模型。综上，该研究从效应子的定位与功能入手，逐步揭示其靶向宿主转录复合物、干扰免疫基因表达的分子机制，为理解植物 - 病原菌互作及抗病策略开发提供了新思路。
02主要研究内容
（1）PsAvh110靶向植物异染色质蛋白
为探究PsAvh110抑制免疫基因表达的机制，研究通过酵母双杂交（Y2H）实验筛选大豆感染大豆疫霉后的cDNA文库，鉴定出其互作蛋白GmLHP1-2；在大豆的4个GmLHP1同源蛋白中，Y2H和Co-IP实验显示PsAvh110与GmLHP1-2相互作用最强，与GmLHP1-1、GmLHP1-4作用较弱，与 GmLHP1-3无作用，且该互作在本氏烟的NbLHP1-1/2中保守存在（经Co-IP和双分子荧光互补实验验证），同时荧光定位观察发现PsAvh110可与GmLHP1-2共定位，并使主要位于核仁的GmLHP1-2部分转移至核质。针对PsAvh110含有的两个W基序，研究构建缺失变体（ΔW1、ΔW2）和点突变体（mW2，W2的GKSE残基突变为丙氨酸），通过体外pull-down、Y2H和Co-IP实验证实仅W2基序（尤其是GKSE残基）是其与GmLHP1-2互作所必需；功能验证显示，在本氏烟中表达仍能互作的 ΔW1变体时，其促辣椒疫霉侵染能力与野生型一致，而丧失互作能力的ΔW2、mW2变体则失去毒力，核定位缺陷的PsAvh110mNLS因无法与GmLHP1-2互作也丧失毒力，表明二者互作依赖核定位，且是PsAvh110发挥毒力的关键。
（2）GmLHP1-2的C端染色质阴影域（CSD）是其与PsAvh110和GmPHD6相互作用所必需的
酵母双杂交（Y2H）和共免疫沉淀（Co-IP）实验显示，GmLHP1-2可与PsAvh110及GmPHD6结合，且PsAvh110与GmLHP1-2的相互作用强于GmPHD6，同时PsAvh110会减少GmLHP1-2与GmPHD6 的结合，提示其可能干扰二者复合物的形成（而PsAvh110不与GmPHD6直接结合）。LHP1含N端染色质域（CD）和C端CSD，研究通过构建GmLHP1-2的四种变体（C端CSD缺失体ΔCSD、不含CD的C端截短体CΔCD、含CD和CSD的C端截短体C、CSD关键残基突变体EHH），经Y2H和Co-IP验证发现，仅含完整CSD的CΔCD和C变体可与PsAvh110及GmPHD6互作，ΔCSD和EHH变体则不能，证实CSD是互作必需结构域。功能实验显示，表达GmLHP1-2或GmPHD6的本氏烟叶片对辣椒疫霉抗性增强，而表达ΔCSD或EHH变体的叶片无抗性，表明GmLHP1-2的CSD通过介导与PsAvh110和GmPHD6的结合，在植物免疫中起关键作用。
（3）PsAvh110与GmPHD6竞争结合GmLHP1-2
为探究PsAvh110是否竞争性干扰GmLHP1-2与GmPHD6的结合，研究通过Co-IP实验发现，当与Flag-PsAvh110共表达时，GFP-GmLHP1-2共沉淀的Flag-GmPHD6蛋白水平显著低于与 Flag-RFP或Flag-PsAvh110mW2共表达的情况。体外pull-down实验进一步证实，随着His-PsAvh110 蛋白量增加，GST-GmLHP1-2共沉淀的Myc-GmPHD6丰度降低，表明PsAvh110可剂量依赖性地干扰GmLHP1-2与GmPHD6的相互作用。此外，微量热泳动（MST）实验显示，GmLHP1-2与PsAvh110 的解离常数（Kd）为7.03 µM±1.75，而与GmPHD6的 Kd为44.83 µM±8.24，说明PsAvh110对 GmLHP1-2的结合亲和力高于GmPHD6，这与Co-IP实验中PsAvh110与GmLHP1-2相互作用更强的结果一致。综上，这些结果表明PsAvh110通过与GmPHD6竞争结合GmLHP1-2，破坏GmPHD6/GmLHP1-2 复合物的形成。
03参考文献
Qiu X, Kong L, Chen H, et al. The Phytophthora sojae nuclear effector PsAvh110 targets a host transcriptional complex to modulate plant immunity. Plant Cell. 2022, 35(1):574–597. doi: 10.1093/plcell/koac300
