解密炭疽菌“间谍”蛋白：借ATP劫持植物免疫，Cx11NC基序藏玄机

解密炭疽菌“间谍”蛋白：借ATP劫持植物免疫，Cx11NC基序藏玄机

在农业领域，植物时刻面临着病原菌的威胁，其中炭疽菌（Colletotrichum）作为一种极具破坏力的病原菌，严重影响着全球范围内多种农作物的产量与品质。它广泛侵袭各类植物，从经济作物到水果、蔬菜，给农业生产带来了沉重打击 。植物在与病原菌长期的斗争过程中，进化出了一套精妙复杂的免疫系统，就像一座坚固的堡垒，能有效抵御病原菌的入侵。然而，炭疽菌也在不断进化，发展出了独特的侵染策略，其中分泌效应蛋白就是其关键的 “武器” 之一 。效应蛋白如同病原菌的 “间谍”，被分泌到植物细胞内，通过各种方式干扰植物的正常生理活动，尤其是免疫系统，以帮助病原菌顺利侵染 。

今天和大家分享一篇关于炭疽菌效应蛋白的全新致病机制的文章。该文章于2025年6月发表在Science Advances杂志上，文章标题为“A Colletotrichum-unique effector with the Cx11NC motif enhances plant NDPK2 kinase activity to suppress plant immunity”。

01研究思路

该研究围绕炭疽菌效应蛋白CfEC92的致病机制，采用递进式思路展开：首先验证CfEC92的分泌转运特性与亚细胞定位，确认其能从真菌分泌至宿主细胞的细胞核和细胞质中发挥作用；接着通过酵母双杂交筛选到互作靶标MdNDPK2，经BiFC、co-IP和pull-down实验验证二者直接相互作用，并明确MdNDPK2的NDK结构域为关键互作区域；随后探究MdNDPK2的功能，发现其作为植物免疫负调控因子，在炭疽菌侵染后上调表达，沉默后增强抗病性、过表达则降低抗病性，且CfEC92的毒力功能依赖于MdNDPK2，二者共表达时感病性更强；进而解析MdNDPK2的调控机制，确定其通过His201自磷酸化激活后，特异性磷酸化MdMPK3，再通过促进水杨酸降解抑制免疫；同时发现 CfEC92能特异性结合ATP，关键位点为Cys26、Asn38、Cys39，ATP结合可改变其二级结构，且此能力是其发挥毒力的必需条件；最终阐明CfEC92-ATP复合物通过改变MdNDPK2构象、增强其与ATP的亲和力，促进其自磷酸化及对MdMPK3的磷酸化，从而抑制植物免疫，且含保守“Cx11NC”基序的炭疽菌同源蛋白也遵循此机制，揭示了炭疽菌“劫持”宿主ATP增强靶标活性以抑制免疫的新策略。

02主要研究内容

（1）CfEC92蛋白与MdNDPK2的NDK结构域相互作用

为解析炭疽菌效应蛋白CfEC92的致病机制，研究通过Western blot检测其分泌特性，结合显微观察与DAPI染色，证实该蛋白可从真菌转运至宿主细胞；利用酵母双杂交（Y2H）筛选到互作靶标 MdNDPK2，再经双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（co-IP）及体外MBP pull-down验证二者直接作用；通过共表达实验与Western blot核质分离检测，明确二者在细胞核和细胞质共定位；构建 MdNDPK2截短突变体，结合Y2H、BiFC及co-IP，锁定其NDK结构域为互作关键区域。

（2）效应蛋白CfEC92通过Cys26、Asn38和Cys39这三个氨基酸残基结合ATP

为确定效应蛋白CfEC92结合ATP的关键区域及残基，研究人员借助AlphaFold 3.0对CfEC92与 ATP进行分子对接并可视化三维结构，预测其20-41位氨基酸形成ATP结合口袋；通过将CfEC92全长分为4个片段，结合微量热泳动（MST）分析发现，包含20-41位氨基酸区域的突变体（CfEC92-m2、CfEC92-m3、CfEC92-m4）在体内仍保留ATP结合活性，体外等温滴定量热法（ITC）实验进一步证实该区域为ATP结合口袋；AlphaFold 3.0还预测出Cys26、Gly30、Phe31、Cys32、Thr33、Asn38、Cys39共6个潜在ATP结合残基，通过构建多个突变体进行MST分析，发现仅 CfEC92GFCT30/31/32/33AAAA突变体保留ATP结合活性，表明Cys26、Asn38和Cys39是CfEC92结合ATP的关键残基，体外ITC实验进一步证实了这一结果。

（3）CfEC92-ATP复合物可改变MdNDPK2的构象，提高其与ATP的亲和力。

为探究CfEC92对MdNDPK2磷酸化的调控机制，研究结合多种技术展开：通过向激酶缓冲液中加入ATP竞争性抑制剂STS，发现其降低MdNDPK2自磷酸化水平，而CfEC92可逆转此效应，结合等温滴定量热法（ITC）证实STS不影响CfEC92与ATP的亲和力，推测CfEC92-ATP可能通过影响 MdNDPK2的ATP结合能力发挥作用；利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和圆二色谱（CD）实验，表明CfEC92-ATP复合物显著改变MdNDPK2的二级结构，而CfEC92单独作用影响较弱；借助 AlphaFold 3.0进行分子动力学模拟，显示该复合物缩短了ATP与MdNDPK2相互作用的氢键长度及组氨酸咪唑环与ATPγ- 磷酸基团的距离；最终通过ITC测定结合常数，证实CfEC92-ATP复合物能显著增强MdNDPK2与ATP的亲和力，而CfEC92单独作用影响较小。

03参考文献

Liu G, Du Y, Chen M, et al. A Colletotrichum-unique effector with the Cx11NC motif enhances plant NDPK2 kinase activity to suppress plant immunity. Science Advances. 2025, 11(25):eadt7970. doi: 10.1126/sciadv.adt7970