从分子机制到产业赋能：PpCDPK29 磷酸化 PpHSFA2a，为桃果耐冷保鲜寻新靶点

从分子机制到产业赋能：PpCDPK29 磷酸化 PpHSFA2a，为桃果耐冷保鲜寻新靶点

采后低温贮藏是延长桃果实货架期、保留品质的常用手段，但桃果对低温敏感，冷害易导致果肉褐变、质地软烂等问题，造成产后损耗，制约产业发展 。探索桃果采后耐冷调控机制、提升耐冷性，成为保障桃产业品质与效益的关键。

今天和大家分享一篇关于桃果实采后冷害耐受性分子调控机制的文章，该文章于2025年2月发表在Plant Biotechnol J杂志上，标题为“Calcium‐dependent protein kinase PpCDPK29‐mediated Ca²⁺‐ROS signal and PpHSFA2a phosphorylation regulate postharvest chilling tolerance of peach fruit”。

01研究思路

本文围绕热水处理（HW）诱导桃果实采后耐冷性机制展开，以“明确HW调控通路”为核心，通过系列技术层层验证：先以HW与HW+DPI处理对比，结合ROS/Ca²⁺浓度检测、抗氧化酶活性测定，证实HW激活ROS-Ca²⁺信号；再聚焦PpCDPK29，借生物信息学分析、转基因番茄（过表达/ CRISPR/Cas9敲除）实验及转录组-代谢组联用，确定其为耐冷正调控因子；随后用酵母双杂交、荧光素酶互补成像、双分子荧光互补、GST pull-down技术，验证PpCDPK29与PpRBOHD/C、PpSOD/PpCAT1的互作；针对PpHSFA2a，通过体外磷酸化实验明确PpCDPK29的磷酸化位点，以瞬时过表达/沉默、双荧光素酶报告、凝胶组织实验（EMSA），证实其对下游抗冷基因的调控及磷酸化对其核定位与DNA结合能力的增强作用，最终揭示HW通过PpCDPK29介导双信号通路缓解冷害的机制。

02主要研究内容

（1）PpCDPK29通过Ca²⁺-ROS信号通路参与活性氧（ROS）的产生与清除

为解析PpCDPK29的调控复合物，研究以其可变N端结构域（VD）和激酶结构域（KD）为诱饵开展酵母双杂交（Y2H）筛选，从阳性克隆中鉴定出PpRBOHD、PpRBOHC、PpSOD、PpCAT14种ROS相关蛋白；先通过实时定量PCR（qRT-PCR）验证基因表达，确认热水处理（HW）可快速短暂诱导PpRBOHD、PpRBOHC及 PpCAT1、PpSOD的表达，再针对PpRBOHD/C，通过靶向Y2H实验（共转化菌株在选择性培养基生长且X-α-gal染色呈蓝）、荧光素酶互补成像（LCI）实验（共转化烟草叶片发更强荧光）、双分子荧光互补（BiFC）实验（二者在烟草细胞膜产生YFP荧光）及GST pull-down实验（体外GST-PpCDPK29与His-PpRBOHD/C结合），从体内外层面证实PpCDPK29与PpRBOHD/C互作以促进ROS产生；针对PpCAT1、PpSOD，同样通过Y2H实验（共转化酵母在选择性培养基生长）、LCI与BiFC实验（二者在植物体内互作产生荧光）及GST pull-down实验（体外GST-PpCDPK29与His-PpCAT1/His-PpSOD结合），证实PpCDPK29与二者互作以增强抗氧化能力、清除过量ROS。

（2）PpCDPK29 对热休克转录因子PpHSFA2a进行磷酸化修饰

pHSFA2a（拟南芥AtHSFA2同源的A类HSF，含DBD、OD等5个功能域，HW 及低温可诱导其表达）是PpCDPK29的互作候选蛋白，研究通过酵母双杂交（Y2H，共转化菌选择性培养基生长且X-α-gal染色呈蓝）、荧光素酶互补成像（LCI，共转化烟草发荧光，且Ca²⁺增强、EGTA减弱荧光）、双分子荧光互补（BiFC，共转化烟草细胞质与细胞核显YFP荧光）及 GST pull-down（GST-PpCDPK29可拉下His-PpHSFA2a）实验，证实二者Ca²⁺依赖性互作；进一步通过体外磷酸化实验（Phos-tag SDS-PAGE显示共孵育出现磷酸化滞后条带，加CIAP后条带消失）证实PpCDPK29可体外磷酸化PpHSFA2a，并经液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定出其3个位于 NLS域的丝氨酸磷酸化位点（Ser243、Ser245、Ser247），磷酸化对其功能的影响待进一步探究。

（3）PpHSFA2a特征分析

以酵母筛选实验（转染菌株在 SD/-Ade/-Leu/-Trp/-Ura 培养基正常生长）与双荧光素酶报告实验（pBD-PpHSFA2a 组 LUC/REN 比值显著高于空载体），证实其具自激活与转录激活活性；借GFP荧光定位观察，发现其常态下分布于细胞质与细胞核，高温（37℃）诱导核转位、低温（4℃）无明显变化；结合前期转录组数据与转录组-代谢组联合分析，筛选出启动子含HSE元件的下游差异基因；通过桃果实瞬时过表达（观察GFP荧光验证蛋白正确表达，检测到过表达后基因在室温2天、低温14天表达量最高，且过表达或与PpCDPK29共感染均上调下游基因）与VIGS沉默实验（沉默后 PpHSFA2a及下游基因表达显著下降），证实这些下游基因可能受其直接调控。

（3）磷酸化增强PpHSFA2a与下游基因的结合能力

先通过双荧光素酶报告（DLR）实验（以p35S-PpHSFA2a-PEAQ为效应载体，6 个下游基因启动子构建至报告载体），发现PpHSFA2a与这些启动子结合的LUC/REN 比值显著高于对照，证实其可直接激活基因转录；再经凝胶阻滞实验（EMSA）验证，无His-PpHSFA2a时探针无迁移，加入该蛋白后形成阻滞条带，冷探针浓度升高阻滞减弱，突变探针无法形成阻滞条带，明确其可直接结合基因启动子的热激元件（HSE）；随后将PpHSFA2a的3个丝氨酸磷酸化位点分别突变为丙氨酸（PpHSFA2a-A，模拟非磷酸化）和天冬氨酸（PpHSFA2a-D，模拟磷酸化），亚细胞定位实验显示 PpHSFA2a-D-GFP主要在细胞核，PpHSFA2a-A-GFP主要在细胞质，表明磷酸化促使其核转移；最后经BCA定量蛋白后开展EMSA，发现PpHSFA2a-D与6个基因启动子 HSE的结合阻滞条带更深，证实其DNA结合能力显著强于野生型与非磷酸化模拟型，说明PpCDPK29对PpHSFA2a的磷酸化可增强其与下游基因的结合能力。

03参考文献

Zhao L, Zhao Y, Bao Y, et al. Calcium‐dependent protein kinase PpCDPK29‐mediated Ca2+‐ROS signal and PpHSFA2a phosphorylation regulate postharvest chilling tolerance of peach fruit. Plant Biotechnol J. 2025, 23(6):1938–1953. doi: 10.1111/pbi.70024