从机制到靶点：PPDPF介导的GTP转移，为KRAS突变胰腺癌提供新疗法方向

从机制到靶点：PPDPF介导的GTP转移，为KRAS突变胰腺癌提供新疗法方向

在恶性肿瘤领域，被称为“癌王”的胰腺导管腺癌（PDAC）因其恶性程度高、早期诊断难、预后极差而备受关注。其中，KRAS基因突变被认为是驱动PDAC发生发展的核心引擎，约90%的PDAC患者存在KRAS突变，但其靶向治疗一直是临床和科研领域的难题。

今天和大家分享一篇关于胰腺导管腺癌（PDAC）中KRAS突变驱动的恶性进展机制的文章，该文章于2022年12月发表在Advanced Science杂志上，标题为“PPDPF Promotes the Development of Mutant KRAS‐Driven Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Regulating the GEF Activity of SOS1”。

01研究思路

该研究围绕PPDPF在突变KRAS驱动的胰腺导管腺癌（PDAC）中的作用展开，通过一系列精准技术手段逐步揭示其机制：首先利用RT-qPCR和组织芯片免疫组化技术，在55对临床样本中证实PPDPF在PDAC组织中mRNA和蛋白水平均显著高表达，且结合Kaplan-Meier生存分析与临床病理关联分析，明确其与肿瘤进展及不良预后的相关性；随后通过基因编辑技术构建PPDPF过表达和敲除细胞系，结合MTT、克隆形成、软琼脂等细胞功能实验，以及裸鼠皮下移植瘤和胰腺原位移植模型，在体内外验证其对PDAC细胞增殖和肿瘤发生的促进作用；在KRASG12D驱动的遗传小鼠模型中，通过胰腺特异性敲除技术进一步证实PPDPF对肿瘤发展的关键作用。机制探究中，采用Co-IP和GST pulldown技术验证PPDPF与SOS1的直接相互作用，并通过截短体突变实验定位结合区域为SOS1的催化结构域（REM 和CDC25域）；利用GST-RBD pulldown技术检测KRAS-GTP水平，结合Western blot分析p-ERK信号，明确PPDPF对RAS/MAPK通路的激活效应；通过GTP结合实验和微量热泳动（MST）技术证实PPDPF 的GTP结合能力，借助质谱鉴定其关键结合位点（Ser6/7），并构建位点突变体验证GTP结合对其功能的必要性；最终通过体外GTP转移实验和SOS1关键区域突变体（R1/R2）功能验证，揭示PPDPF通过将GTP转移至SOS1增强其GEF活性，进而激活KRAS的全新机制，为PDAC治疗提供了基于该调控轴的潜在靶点。

02主要研究内容

（1）PPDPF 的促肿瘤作用依赖于 SOS1 的鸟苷酸交换因子（GEF）活性

利用Co-IP实验在293T细胞和Miapaca2细胞中分别证实外源性和内源性PPDPF与SOS1存在相互作用；随后通过构建SOS1敲除的PDAC细胞系（Miapaca2、HPAC），结合MTT、克隆形成及软琼脂实验，发现PPDPF过表达仅能促进SOS1野生型细胞的生长，而对SOS1敲除细胞无显著影响，表明SOS1是PPDPF发挥促瘤作用的必需因子；为进一步明确作用机制，利用SOS1截短突变体结合 Co-IP实验，确定PPDPF主要与SOS1的REM和CDC25结构域相互作用，且GST pulldown实验证实两者直接结合；通过GEF活性实验观察到，EGF刺激后的PPDPF可增强SOS1 Cat域的活性，提示 EGF可能诱导PPDPF发生功能改变；最后，借助GTP结合实验和微量热泳动（MST）技术证实PPDPF 能结合GTP，且GEF活性实验进一步显示，仅GTP结合状态的PPDPF可增强SOS1 Cat域的活性，未结合GTP的PPDPF无此效应，明确GTP负载是PPDPF调控SOS1的关键。

（2）PPDPF的肿瘤促进功能需要GTP结合能力

通过质谱（MS）鉴定出PPDPF的GTP结合位点为丝氨酸 6（Ser6）和丝氨酸 7（Ser7）。参照先前研究，将这两个位点的丝氨酸突变为亮氨酸，构建了三种突变体（S6L、S7L 和 S6L/7L）。通过GTP结合实验检测突变体的GTP结合能力，发现三种突变体的GTP结合能力均显著受损，其中PPDPF（S6L/7L）对GTP的亲和力最低。为明确这些突变体对RAS/MAPK信号通路的影响，研究检测了过表达野生型 PPDPF（WT）或PPDPF（S6L/7L）的PDAC细胞中p-ERK和KRAS-GTP的水平，结果显示，与过表达野生型PPDPF的细胞相比，过表达PPDPF（S6L/7L）的PDAC细胞中p-ERK和KRAS-GTP的水平显著降低。PPDPF（S6L/7L）几乎丧失了增强SOS1Cat的GEF活性的能力。此外，S6L/7L突变还削弱了PPDPF在体外和体内的促生长作用。综上，PPDPF的GTP结合能力是其通过RAS/MAPK信号通路发挥促肿瘤作用所必需的。

（3）GTP从PPDPF向SOS1的转移对PPDPF-SOS1轴的促肿瘤作用至关重要

通过GTP结合实验证实SOS1可结合GTP，共孵育实验显示PPDPF-GTP与SOS1Cat作用后，PPDPF 结合的GTP减少而SOS1Cat结合的GTP增加，直接证明GTP转移；利用综合分析定位SOS1Cat中与PPDPF Ser6/7互作的GTP接收区域（Cat-R1：807–814，Cat-R2：896–909），构建关键氨基酸突变体（SOS1Cat-R1/R2 等）；通过Co-IP验证突变体与PPDPF的相互作用显著减弱，GTP结合实验显示其GTP结合能力下降；Western blot和GEF活性实验表明，突变体无法有效激活KRAS-GTP和p-ERK，且在PPDPF-GTP存在时仍丧失GEF活性；功能实验（体外增殖、体内成瘤）显示突变体无促肿瘤作用，而野生型SOS1作用显著。最终提出模型：EGF刺激下，PPDPF结合GTP并转移至SOS1，增强其GEF活性，激活KRAS及下游信号。

03参考文献

Ni QZ, Zhu B, Ji Y, et al. PPDPF Promotes the Development of Mutant KRAS‐Driven Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Regulating the GEF Activity of SOS1. Advanced Science. 2022, 10(2):2202448. doi: 10.1002/advs.202202448