从实验到田间：ARF基因调控机制为玉米育种带来新方向

从实验到田间：ARF基因调控机制为玉米育种带来新方向

在农业生产中，玉米作为全球广泛种植的重要农作物，其籽粒性状直接影响产量、品质及收获储存等环节。硬粒玉米籽粒偏小但硬质胚乳丰富，容重高、脱水快且耐储运；而马齿型玉米籽粒较大，却因上部胚乳灌浆不足导致籽粒上部塌陷，粉质胚乳占比高，脱水慢、容重低，给机械收获和长期储藏带来不便。长久以来，育种专家期望培育兼具马齿型大籽粒与硬粒型优良物理特性（如浅马齿、硬粒外观、高容重、快速脱水、适合机械收获）的品种，但由于这两种性状受母体基因型控制且由多个微效基因调控，构建遗传研究群体难度极大，当代基因型需通过下一代籽粒表型判断，导致控制马齿型向硬粒型转变的关键基因长期未被克隆，研究进展缓慢。

今天和大家分享一篇关于玉米籽粒性状转变奥秘的文章，该文章于2024年3月发表在Nat Commun杂志上，文章标题为“An ARF gene mutation creates flint kernel architecture in dent maize”。

01研究思路

该研究以玉米籽粒性状改良为目标，通过系列实验技术层层推进揭示ARFTF17突变塑造硬粒表型的机制：首先利用EMS诱变技术构建B73突变体库，结合表型观察与参数测量（如籽粒形态、硬质胚乳占比、脱水速率等）筛选获得硬粒表型突变体fka1-1；通过BSA测序技术定位候选基因，借助等位测试、CRISPR/Cas9 基因编辑及转基因互补实验验证ARFTF17为关键调控基因。在细胞学机制解析中，采用半薄切片光学显微镜观察和透射电子显微镜（TEM） 分析果皮细胞长度、数量及形态变化，明确果皮发育异常与表型的关联。分子机制探究中，通过RNA-seq 转录组分析筛选差异表达基因（如 PIN1、CHS、DFR），代谢组学技术鉴定类黄酮等差异代谢物；利用双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和 pull-down 实验验证ARFTF17与MYB40的互作，通过凝胶阻滞实验（EMSA） 检测蛋白与基因启动子的结合，双荧光素酶报告基因（LUC）实验解析基因表达调控关系，结合RT-qPCR和免疫印迹（Western blot） 验证基因转录与蛋白水平变化。遗传验证阶段，通过MYB40 过表达、RNA干扰及PIN1突变体实验确证通路功能；最终在育种应用评估中，利用田间实验结合籽粒抗破损性测试、含水量及产量测定，证实 ARFTF17 突变在不同遗传背景下的改良效果。这些实验技术的综合应用，从表型筛选、基因克隆到机制解析与应用验证，构建了完整的研究闭环，揭示了 ARFTF17 通过调控生长素和类黄酮代谢影响玉米籽粒表型的新机制。

02主要研究内容

（1）FKA1 编码 ARF 转录因子 ARFTF17

为克隆控制fka1-1突变体硬粒表型的基因，研究人员将其与野生型B73杂交构建F2群体，发现 F3籽粒马齿与硬粒表型分离比约为3:1，表明该表型由单隐性基因控制；通过BSA测序定位5号染色体27-29 Mb区间，其中仅Zm00001d014013存在C→T突变，导致翻译提前终止，该基因编码ARF 转录因子ARFTF17。RT-qPCR和GFP报告基因实验显示ARFTF17在发育种子的果皮中高表达，蛋白在果皮中积累量更高，而突变体果皮中其转录和蛋白水平显著降低，为无效等位基因。进一步通过另一个EMS等位突变体fka1-2（同基因终止突变）的杂交实验，以及ARFTF17转基因互补实验，最终证实Zm00001d014013（ARFTF17）突变是硬粒表型的成因。

（2）ARFTF17 通过与 MYB40 相互作用调控下游基因

为探究ARFTF17调控下游基因的分子机制，研究首先通过瞬时表达实验观察到ARFTF17-eGFP定位于细胞核，符合转录因子的特征；但凝胶阻滞实验（EMSA） 显示，ARFTF17无法结合DR5启动子或含生长素响应元件（TGTCTC）的 P3 (2x) 片段，结合DNA 亲和纯化测序（DAP-seq） 结果（C族ARF无特异性结合峰），推测其可能通过与其他转录因子互作调控基因表达。鉴于ARFTF17 突变体中类黄酮合成基因显著上调，而该通路受玉米P基因家族调控，结合RNA-seq 数据筛选出果皮中高表达的MYB40（其他家族成员不表达或功能异常），进而通过双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）及 pull-down实验，证实ARFTF17与MYB40存在直接相互作用。为明确功能关系，采用双荧光素酶报告基因（LUC）实验发现，MYB40可激活CHS和DFR启动子的转录活性，而ARFTF17与MYB40共表达时，这种激活作用被显著抑制；EMSA实验进一步验证，MYB40（而非 ARFTF17）能结合 CHS和DFR启动子中的P1核心motif。综上，ARFTF17通过与MYB40互作，抑制其对下游类黄酮合成基因（CHS、DFR）的转录激活功能，从而调控相关通路。

（3）ARFTF17-MYB40 模块调控硬粒型籽粒结构

为验证ARFTF17-MYB40模块调控籽粒结构的功能，在B73中过表达MYB40，转基因株系表现出与ARFTF17突变体相似的硬粒表型（顶部凸圆、硬质胚乳增多、果皮缩短）。通过RNAi沉默MYB40 后，ARFTF17突变诱导的硬粒表型被抑制，表明MYB40是ARFTF17功能依赖的关键因子。MYB40过表达导致果皮IAA含量下降、PIN1表达下调，EMSA和LUC实验证实MYB40可直接结合并抑制 PIN1启动子活性，而ARFTF17可部分解除这种抑制。从MEMD数据库筛选到的PIN1突变体也表现出硬粒表型，且IAA含量降低。综上，ARFTF17突变增强MYB40功能，通过抑制PIN1表达和促进类黄酮合成（CHS/DFR），降低果皮IAA水平，最终导致硬粒型籽粒形成。

03参考文献

Wang H, Huang Y, Li Y, et al. An ARF gene mutation creates flint kernel architecture in dent maize. Nat Commun. 2024, doi: 10.1038/s41467-024-46955-9