苹果优质育种新靶点锁定！MdCPCL-MdILR3L调控维生素C与花青素机制登顶刊

在果树产业中，苹果的市场竞争力不仅取决于产量，更与果实的营养品质和外观特性紧密挂钩。随着消费者健康意识提升，抗坏血酸（维生素 C） 的抗氧化、增强免疫力功能，以及花青素的护色、延长货架期与潜在保健价值，已成为衡量苹果“优质性”的核心标准，也是育种企业与种植端追求的关键目标。如何通过分子层面的调控，实现这两种物质的高效协同合成，始终是行业亟待突破的技术难点。

今天和大家分享一篇关于聚焦苹果分子生物学与品质调控研究的文章，该文章于2025年1月发表在Plant Biotechnol J杂志上，标题为“The regulatory module MdCPCL‐MdILR3L mediates the synthesis of ascorbic acid and anthocyanin in apple”。

01. 研究思路

本研究以分子生物学技术为核心探究苹果抗坏血酸（AsA）与花青素协同合成机制：针对普通苹果果肉两物质含量低的问题，选取含红肉/非红肉株系的新疆红肉苹果二代杂交群体为材料，经含量测定与基因关联分析，发现红肉株系AsA含量为非红肉16倍，且与 MdGLDH表达（r=0.94）、花青素含量（r=0.90）强相关，锁定MdGLDH为关键基因；随后以MdGLDH启动子为诱饵，通过酵母单杂交（Y1H） 筛选到R3型 MYB 转录因子 MdCPCL，结合生物信息学分析确认其核定位特征，再经EMSA和ChIP技术证实其可特异性结合MdGLDH启动子MBS元件，双荧光素酶报告（LUC）实验验证其转录激活作用；接着通过CRISPR/Cas9 基因编辑构建MdCPCL敲低愈伤，结合过表达载体与果实瞬时实验，双向验证MdCPCL正向调控两物质合成；最后经酵母双杂交（Y2H）筛选到互作的 bHLH因子MdILR3L，pull-down、LCI、BiFC技术证实体内外互作，且MdILR3L可增强 MdCPCL 与MdGLDH、MdANS启动子的结合及激活能力，最终构建复合体调控模型，为苹果品质育种提供靶点。

02. 主要研究内容

（1）R3型MYB转录因子MdCPCL与MdGLDH启动子的结合机制

为明确R3型MYB转录因子MdCPCL与抗坏血酸合成关键酶基因MdGLDH启动子的相互作用，研究人员首先以MdGLDH启动子为诱饵，经酵母单杂交（Y1H）筛选鉴定出 MdCPCL且共转化MdCPCL-AD与proMdGLDH-pHIS2的Y187酵母细胞可在含60 mM 3-AT的- T-H-L选择性培养基上生长，初步证实二者结合；接着通过顺式作用元件分析发现 MdGLDH启动子含4个MYB结合位点（MBS），再经凝胶阻滞实验（EMSA）进一步验证MdCPCL可特异性结合其中2 个MBS元件，且竞争探针会降低结合强度、突变探针则完全消除结合，明确结合的序列特异性；随后在转基因 “王林” 苹果愈伤组织中，利用染色质免疫沉淀（ChIP）实验富集到含MBS元件的MdGLDH启动子片段，证实体内结合关系；最后通过荧光素酶报告基因（LUC）实验发现，MdCPCL能显著激活MdGLDH启动子活性（P<0.05）并促进其转录。同时，生物信息学分析显示MdCPCL含高度保守的SANT 结构域（推测为 DNA 结合关键模块）、与PbCPCL1同源性高且定位于细胞核，上述多技术协同证明MdCPCL通过SANT结构域特异性结合MdGLDH启动子MBS元件并激活其转录，为解析苹果抗坏血酸合成调控机制提供关键依据。

（2）MdCPCL 直接结合花青素合成途径中结构基因MdANS的启动子

鉴于MdCPCL过表达愈伤组织中MdANS和MdUFGT的表达量显著升高，我们推测 MdCPCL可能与MdANS和MdUFGT的启动子存在相互作用。酵母单杂交（Y1H）实验显示，共转化MdCPCL-AD与proMdANS-pHIS2的Y187感受态细胞能在含80 mM 3-AT的 - T-H-L 选择性培养基上生长；而MdCPCL-AD与proMdUFGT-pHIS2共转化细胞未检测到相互作用。对MdANS启动子的进一步分析发现其含有两个MYB转录因子结合元件。为验证MdCPCL与MdANS启动子的相互作用，我们进行了凝胶阻滞实验（EMSA），结果显示MdCPCL可结合MBS顺式元件，且随着竞争探针浓度增加，结合能力逐渐减弱；当标记探针替换为突变探针时，未检测到结合信号。此外，荧光素酶报告基因（LUC）实验证实MdCPCL能显著激活MdANS启动子。染色质免疫沉淀（ChIP）实验也证明了二者的结合，在MdCPCL-GFP转基因"王林"愈伤组织中，含MBS顺式元件的MdANS启动子片段被特异性富集。

（3）MdCPCL 与 MdILR3L 在体内外的相互作用

通过酵母双杂交（Y2H）筛选，鉴定出一个bHLH转录因子MdILR3L。MdILR3L的编码序列（CDS）可翻译生成含238个氨基酸的蛋白质。同源片段分析和氨基酸序列比对证实，MdILR3L含有高度保守的HLH结构域，且其转录产物在细胞核中表达。酵母双杂交实验进一步证实了MdCPCL与MdILR3L之间的相互作用。下拉实验（pull-down）显示，利用抗GST抗体进行的蛋白质印迹分析能成功检测到MdCPCL-GST，但无法检测到单独的 GST，这表明MdILR3L-HIS可下拉MdCPCL-GST而非GST，证实了二者在体外的相互作用，反向验证结果一致。烟草叶片中的荧光素酶互补成像（LCI）实验显示，共表达 MdCPCL-cLUC与MdILR3L-nLUC产生的荧光信号显著强于对照。此外，双分子荧光互补实验（BiFC）显示，共转化35S:MdCPCL-CYFP与35S:MdILR3L-NYFP的烟草叶片表皮细胞中可观察到YFP荧光，而共转化35S:MdCPCL-CYFP与35S:NYFP或35S:MdILR3L-NYFP与 35S:CYFP的细胞中未检测到YFP荧光，表明MdCPCL与MdILR3L在体内存在相互作用。

（4）MdCPCL-MdILR3L 复合体促进苹果中抗坏血酸（AsA）和花青素的合成

鉴于MdCPCL与MdILR3L可形成异源二聚体，研究人员进一步研究了该复合体是否影响抗坏血酸（AsA）和花青素的合成。将MdCPCL与MdILR3L共转化至"王林"苹果愈伤组织中，获得了3个独立的稳定转基因株系。通过不同标记抗体检测、RT-qPCR 分析及序列鉴定，证实了转基因的存在。在光照培养条件下，共转化愈伤组织中抗坏血酸和花青素的积累量以及MdGLDH和MdANS基因的相对表达量均高于单独过表达MdCPCL的愈伤组织，表明MdCPCL-MdILR3L复合体可进一步促进抗坏血酸和花青素的积累。为探究该复合体对MdGLDH和MdANS启动子的影响，我们进行了EMSA实验，结果显示添加 MdILR3L-GST后，MdCPCL与MdGLDH和MdANS启动子的结合强度显著增强，表明该复合体可增强与下游基因启动子的结合能力。此外，荧光素酶报告基因（LUC）实验显示，proGLDH/proANS::LUC与35S::CPCL和35S::ILR3L共表达时的发光强度高于 proGLDH/proANS::LUC与35S::CPCL单独共表达的情况。这些结果表明，MdCPCL与 MdILR3L相互作用可促进下游基因的转录，从而增加抗坏血酸和花青素的积累。

03. 参考文献