肝癌代谢靶向新靶点！BD阻断ICAT/β-catenin相互作用，抑制HIF-1α介导糖代谢

肝细胞癌（HCC）是全球范围内恶性程度极高的肿瘤之一，肿瘤代谢重编程是其恶性进展的核心驱动力，其中缺氧诱导因子- 1α（HIF-1α）介导的糖代谢异常亢进，为肝癌细胞快速增殖、适应肿瘤微环境提供了关键能量支撑。HIF-1α的活性与β- 连环蛋白（β-catenin）通路密切关联，而ICAT作为β-catenin的天然抑制因子，其与 β-catenin的相互作用平衡直接调控通路活性，进而深刻影响HIF-1α介导的糖代谢网络。当前肝癌治疗仍面临耐药、复发率高等难题，针对代谢关键节点的精准干预成为突破治疗瓶颈的迫切需求。

今天和大家分享一篇关于鸦胆子素D（Bruceine D）通过阻断ICAT/β-catenin相互作用，抑制肝细胞癌中HIF-1α介导的糖代谢的研究文章。该文章于2021年5月发表在Acta Pharm Sin B杂志上，标题为“Bruceine D inhibits HIF-1α-mediated glucose metabolism in hepatocellular carcinoma by blocking ICAT/β-catenin interaction”。

01. 研究思路

本研究针对肝细胞癌（HCC）缺氧微环境下HIF-1α介导糖代谢重编程的临床难题，以天然产物鸦胆子素D（BD）为研究工具，先通过CCK-8、活死细胞染色等表型技术明确其对HCC细胞增殖及HIF-1α的特异性抑制，再借助Seahorse细胞能量代谢分析、糖摄取/乳酸检测等技术解析BD对HIF-1α介导糖代谢重编程的抑制效应；继而运用DARTS、CETSA等技术筛选并聚焦靶点ICAT，结合MST和分子对接技术直接验证BD与ICAT的结合及关键作用位点；随后通过敲低ICAT、Co-IP等实验技术，阐明 BD结合ICAT后破坏其与β-catenin的相互作用、促进β-catenin降解进而抑制HIF-1α 合成的调控链，且敲低ICAT的反向验证进一步夯实ICAT的核心功能；最终借助 Huh7裸鼠移植瘤模型的体内实验，结合瘤内蛋白表达检测、组织学分析等技术闭环验证机制，全程以DARTS、CETSA、MST等生物物理技术和Seahorse代谢分析为核心技术支撑，完整揭示BD通过“ICAT→β-catenin→HIF-1α”轴调控HCC代谢重编程的分子逻辑，为HCC代谢靶向治疗提供了技术驱动的机制创新与药物研发方向。

02. 主要研究内容

（1）ICAT是BD的直接靶点

为探究BD调控HIF-1α的分子靶点，本研究基于“小分子结合蛋白在蛋白水解过程中会被保护并富集”的原理，采用DARTS结合质谱的定量蛋白质组学策略筛选潜在直接结合蛋白，结合BD可抑制β-catenin及HCC中β-catenin与HIF-1α表达正相关的背景，优先聚焦β-catenin信号抑制因子ICAT；随后通过CETSA证实，100 μmol/L BD 可提升HepG2、Huh7细胞中ICAT的热稳定性；为明确结合类型与位点，经质谱分析排除BD与ICAT的共价结合后，通过分子对接预测到BD与ICAT的Lys28形成氢键，并与Leu24、Leu52、Met25存在疏水作用，进一步采用MST直接测定BD与野生型 ICAT的结合亲和力（Kd≈33 μmol/L），且通过定点突变构建Lys28突变体后，MST显示其结合亲和力显著降低（Kd≈250 μmol/L），最终从技术层面完整验证ICAT是BD 的直接靶点，且Lys28为关键结合位点。

（2）BD靶向ICAT干扰β-catenin/HIF-1α轴抑制HCC糖代谢的机制

研究通过ICAT小干扰RNA（si-ICAT）敲低HepG2和Huh7细胞中的ICAT，发现其可显著逆转BD对HIF-1α及下游糖酵解相关蛋白（LDHA、GLUT1/3、HK2、PKM2）的抑制作用，同时缓解BD对HCC细胞糖摄取和L - 乳酸生成的抑制，证实 ICAT是BD调控β-catenin/HIF-1α通路及糖代谢的关键靶点。已知ICAT可阻断β-catenin与TCF/LEF结合，还能通过竞争APC结合位点稳定β-catenin。进一步实验显示，BD在缺氧条件下剂量依赖性抑制β-catenin表达，且蛋白酶体抑制剂MG-132可逆转该效应，提示BD通过蛋白酶体依赖途径降解β-catenin。免疫共沉淀（Co-IP）实验证实，BD可减弱ICAT过表达细胞中β-catenin与ICAT的直接结合，且β-catenin 敲低后HIF-1α表达显著降低。为明确BD抑制HIF-1α的机制，MG-132处理显示BD 可阻断HIF-1α积累，蛋白翻译抑制剂CHX表明BD不影响其降解速率，qRT-PCR证实HIF-1α mRNA水平无变化，说明BD通过抑制其蛋白翻译发挥作用。综上，BD直接靶向ICAT，干扰其与β-catenin的相互作用并促进后者降解，进而调控HIF-1α表达，为其抑制HCC糖代谢的机制提供了关键实验依据。

（3）BD抑制异种移植瘤的生长

为评估BD的体内抗肿瘤活性，本研究构建Huh7细胞裸鼠皮下移植瘤模型，以 0.75 mg/kg/天和1.5 mg/kg/天的剂量对实验小鼠进行连续两周尾静脉注射给药。结果显示，1.5 mg/kg/天的BD处理组可显著抑制移植瘤生长，且所有给药组小鼠均未出现明显体重下降及副作用。对肿瘤组织的病理与免疫组织化学分析表明，1.5 mg/kg/天的BD处理可使肿瘤坏死面积显著增加、TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）增多，同时减少Ki67阳性细胞（增殖细胞）。与体外实验结果一致，BD处理后瘤组织中HIF-1α、β-catenin、GLUT1/3、LDHA、ICAT及Cyt c的蛋白水平均显著下调，进一步在体内验证了BD通过调控“ICAT→β-catenin→HIF-1α”轴抑制HCC进展的作用。

03. 参考文献

Huang R, Zhang LJ, Jin JM, et al. Bruceine D inhibits HIF-1α-mediated glucose metabolism in hepatocellular carcinoma by blocking ICAT/β-catenin interaction. Acta Pharm Sin B. 2021, 11(11):3481–3492. doi: 10.1016/j.apsb.2021.05.009