TurboID之鉴定细胞分泌蛋白：不同生理条件下细胞分泌蛋白鉴定

研究者通过TurboID的实验技术手段，捕获并富集源自与人内皮细胞和星形胶质细胞共培养的球体内人脑周细胞的分泌蛋白，结合质谱和多重免疫测定，确定了不同处理条件下周细胞分泌的蛋白质。

脑内细胞通讯对于维持稳态和对病理触发因素如缺氧做出有效反应至关重要，然而，对分泌分子的精确组成和动态释放的全面理解一直难以实现。为了克服这些局限性，我们利用了非毒性生物素连接酶TurboID的潜力：1. 使用TurboID进行分泌组分析，并优化蛋白质回收方法，2. 利用该方法表征周细胞在血脑屏障中对缺氧刺激的特定信号，3. 表征单周细胞培养和共培养分泌组之间的差异。这项研究对识别旨在调节与缺氧相关的脑部病变中的微血管信号的目标治疗策略具有重要意义。

2024年5月，来自瑞典隆德大学的Gesine Paul教授团队，在期刊Mol Cell Proteomics （生化研究方法1区，IF:5.5，Top期刊）上发表文章Pericyte-Specific Secretome Profiling in Hypoxia Using TurboID in a Multicellular in Vitro Spheroid Model。该研究通过构建人脑周细胞、人脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞的球形共培养体系，并通过构建人脑周细胞的内质网锚定TurboID，鉴定了缺氧条件、单独培养条件及共培养条件下，人脑周细胞分泌蛋白的差异。该研究对细胞特异性分泌组分析的方法学方面提供了独特的见解。

1. 共培养体系中TurboID 活性和分泌蛋白的生物素化

研究者首先鉴定了TurboID在周细胞内的活性，通过免疫荧光实验，证实周细胞都表达了TurboID，并且与ER标记物 calnexin 共定位，接着，研究者通过收集细胞培养液上清，明确了只有在存在外源生物素的情况下表达TurboID连接酶才会发生蛋白质标记。接着，研究者通过构建TurboID-人周细胞稳转表达细胞，再与人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞组成球体共培养体系，通过免疫印迹实验，研究者发现常氧和缺氧环境中均观察到了强效的链霉抗生物素蛋白印迹信号。

2. 分泌蛋白的蛋白质组学研究

研究者将不同条件下的周细胞分泌蛋白富集起来，通过LC-MS/MS对各组周细胞的分泌蛋白进行鉴定。

小结

本研究通过构建周细胞内的内质网锚定TurboID，将周细胞内的所有分泌蛋白进行无差别的生物素标记，再通过链素亲和素将所有的生物素标记蛋白富集起来，进行LC-MS/MS，鉴定出周细胞的分泌蛋白，为血脑屏障细胞间互作导致的分泌蛋白鉴定提供了新的见解和实验方法。

参考文献

1. Enstrom, A., R. Carlsson, C. Buizza, M. Lewi, and G. Paul, Pericyte-Specific Secretome Profiling in Hypoxia Using TurboID in a Multicellular in Vitro Spheroid Model. Mol Cell Proteomics, 2024. 23(6): p. 100782, http://doi/ 10.1016/j.mcpro.2024.100782