TurboID之鉴定胞内互作蛋白：筛选靶标蛋白的潜在互作蛋白

研究者通过构建靶标蛋白-TurboID融合表达的实验技术手段，将与靶标蛋白潜在结合蛋白质进行生物素标记，并通过链素亲和素磁珠富集生物素标记的蛋白，结合质谱和定量蛋白质组学，确定了靶标蛋白CRBN的结合互作蛋白。

研究者们通过TurboID及定量蛋白质组学的方法，在CRBN 相互作用组中鉴定出了组蛋白去甲基化酶 KDM5C，并表明KDM5C 能够与 CRBN 结合并使其稳定，而且 KDM5C 抑制剂对 CRBN 没有影响，表明 KDM5C 以酶活性非依赖的方式调节 CRBN。

2025年1月，来自苏州大学的周亮老师团队，在期刊Cell Mol Biol Lett（生物学1区，IF: 10.2，Top期刊）上发表文章The histone demethylase KDM5C enhances the sensitivity of acute myeloid leukemia cells to lenalidomide by stabilizing cereblon。该研究通过构建CRBN-TurboID融合表达载体，转染至HEK293T细胞中过表达，富集出与CRBN存在潜在相互作用的蛋白，接着通过蛋白质组学的方式，验证CRBN与相互作用蛋白KDM5C的作用方式，结果证明，组蛋白去甲基化酶KDM5C通过非酶活依赖的方式调控CRBN的蛋白稳定性。

1. CRBN互作蛋白的筛选

研究者首先构建了CRBN-TurboID的融合表达质粒，将其转染至HEK293T细胞中，通过生物素富集到NAC1、PICALM和组蛋白去甲基酶KDM5C作为特定的CRBN相互作用蛋白，并通过共沉淀的方式进行了验证，且在AML细胞系THP1和NB4中，同样验证了内源性KDM5C可以结合CRBN。

2. KDM5C与CRBN互作方式鉴定

研究者通过构建siRNA，在多细胞系中确定KDM5C降低，导致CRBN蛋白水平下降且不影响其mRNA水平，并通过泛素-蛋白酶体系统抑制剂MG132和自噬-溶酶体途径抑制剂Baf A1抑制细胞内两种主要降解途径，发现其对KDM5C-CRBN并无显著影响，研究者通过筛选大量的胞内信号通路抑制剂，确定Neddylation抑制剂MLN4924稳定提升KDM5C表达，并通过CHX实验确定了这一想法，且通过添加KDM5C抑制剂CPI-455、KDM5-IN-1，表明KDM5C不依赖酶活途径稳定CRBN的表达。

小结

本研究通过构建在HEK293T细胞内转染CRBN-TurboID融合表达质粒，无差别筛选与CRBN结合互作的蛋白，最终筛选出组蛋白去甲基化酶KDM5C，并通过一系列的蛋白检测方法，在多个AML细胞系内验证了KDM5C以非酶活依赖的方式促进CRBN的稳定性。

参考文献

1. Zou, L., D. Cao, Q. Sun, W. Yu, B. Li, G. Xu, and L. Zhou, The histone demethylase KDM5C enhances the sensitivity of acute myeloid leukemia cells to lenalidomide by stabilizing cereblon. Cell Mol Biol Lett, 2025. 30(1): p. 14, http://doi/ 10.1186/s11658-025-00697-8