细胞热迁移技术（CETSA）

CETSA（Cellular Thermal Shift Assay，细胞热迁移实验）技术结果案例图

原理简介

蛋白质受热后发生构象解折叠、聚集沉淀；小分子药物特异性结合靶蛋白后，可稳定蛋白空间构象，提升热稳定性。

游离靶蛋白：较低温度即可变性沉淀；

药物 - 靶蛋白复合物：耐受更高温度，同等温度下可溶性蛋白更多。

实验通过梯度温度热处理，离心分离可溶性上清与变性沉淀；利用 WB 定量上清内目标蛋白丰度，绘制热熔解曲线。

若给药组曲线相对溶剂对照组右移、熔解温度 Tm 升高，证明细胞内药物与靶蛋白发生特异性结合。

少数配体结合会使蛋白稳定性下降、曲线左移，同样提示存在相互作用。

技术优势

1.       原位生理环境：可在完整活细胞、原代组织、临床样本开展，保留内源蛋白修饰、蛋白 - 蛋白相互作用，相比体外纯化蛋白 TSA 更贴近胞内真实情况；

2.       无标记、无需蛋白纯化：不需要对小分子药物进行生物素 / 荧光标记，适合膜蛋白、难纯化内源靶点；

3.       常规实验室平台即可实现：仅需要 PCR 仪、WB 系统，门槛低于 CETSA-MS（TPP 热蛋白质组分析）；

4.       直接检测内源性蛋白，不受过表达系统带来的假阳性干扰。

实验模式

1.       温度梯度模式（熔解曲线实验）

设置一系列温度（常见 37～65/67 ℃），固定药物浓度，获取完整熔解曲线，直观判断能否结合。

2.       等温剂量响应模式（ITDR）

选定单一临界温度（约 50% 蛋白沉淀温度），设置药物浓度梯度，定量结合强弱，估算胞内靶点占据效力。

实验流程

1.       细胞 / 组织分组：药物处理组 + DMSO 溶剂对照组；

2.       样本均分至 PCR 管，梯度温度短时热激；

3.       冰浴冷却、温和裂解，高速离心去除变性蛋白沉淀；

4.       收集上清（可溶性蛋白组分），进行 Western Blot；

5.       灰度定量，归一化拟合热熔曲线，比较两组 Tm 差异。

应用场景

1.       验证小分子、天然产物是否在胞内结合预测靶蛋白（常用于分子对接、Pull-down 结果的体内验证）；

2.       比较不同衍生物的靶点结合能力、构效关系研究；

3.       评估药物细胞膜穿透性与胞内靶点占据水平；

4.       区分特异性结合与体外非特异性相互作用；

5.       动物组织水平验证药物在体内的靶点结合。

参考文献

1.       Zhang, X., et al., A novel taxane SB-T-101141 triggers a noncanonical ferroptosis to overcome Paclitaxel resistance of breast cancer via iron homeostasis-related KHSRP. Cell Death Dis, 2025. 16(1): p. 403.

2.       Wang, Q., et al., Benzosceptrin C induces lysosomal degradation of PD-L1 and promotes antitumor immunity by targeting DHHC3. Cell Rep Med, 2024. 5(2): p. 101357.