药物亲和响应靶标稳定性技术（DARTS）

DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability，药物亲和响应靶标稳定性）技术结果案例图

原理简介

小分子药物与靶蛋白特异性结合后，引发蛋白构象改变、结构刚性提升，遮蔽蛋白酶酶切位点，增强抵抗有限蛋白酶水解的能力。

DMSO 对照组（无药物）：靶蛋白易被蛋白酶降解，WB 条带信号弱；

药物处理组：结合药物的靶蛋白得到保护，同等酶切条件下完整蛋白更多，WB 条带更强。

极少数配体结合会松动蛋白结构、加速降解（条带变弱），同样提示二者存在相互作用。

技术优势

1.       无标记：小分子无需生物素 / 荧光修饰，保留天然结构，规避探针改造带来的假阴性；

2.       体系灵活：粗细胞裂解液、纯化蛋白均可开展；

3.       操作简单、门槛低，常规 WB 平台即可完成；

4.       适合初筛验证，常用来验证 Pull-down、分子对接预测的候选靶点；

5.       无洗涤步骤，对部分低亲和力相互作用检出能力优于亲和钓取实验。

实验流程

1.       样本制备：非变性裂解液提取细胞总蛋白（保持天然构象）；

2.       分组孵育：蛋白裂解液分为溶剂对照组、药物处理组，室温孵育使药物与蛋白充分结合；

3.       限制性酶解：加入梯度稀释广谱蛋白酶（Pronase / 蛋白酶 K / 嗜热菌蛋白酶），短时间可控酶切；

4.       终止消化：立即加入蛋白上样缓冲液煮沸灭活蛋白酶；

5.       Western Blot 检测，灰度定量比较目的蛋白剩余量；

6.       结果判读：相同酶切条件下，给药组蛋白丰度显著高于对照组，判定存在直接结合。

应用场景

1.       验证小分子、天然产物与候选靶蛋白体外直接相互作用；

2.       对比系列衍生物与同一靶点的结合能力，辅助构效关系研究；

3.       DARTS-MS 全蛋白组靶点筛选后，使用 DARTS-WB 逐个验证候选靶点；

4.       作为 Pull-down、分子对接结果的第一轮体外验证手段。

参考文献

          Hu, H., et al., Berberine Derivative B68 Promotes Tumor Immune Clearance by Dual-Targeting BMI1 for Senescence Induction and CSN5 for PD-L1 Degradation. Adv Sci (Weinh), 2025. 12(7): p. e2413122.